מימוש מהיר של תכני ציטומטר זרימה באמצעות מודולי איסוף נתונים עם דיוק גבוה

ציטומטריית זרימה היא בשימוש נרחב על ידי קלינאים ומאבחנים לניתוח מאפייני התא. עם תא אחד בכל פעם, הם מעריכים אופטית את רמות החלבון, בריאות הדם, הגרנולריות וגודל התא, לצד תכונות אחרות. למרות שמדובר במערכות רגישות ביותר, מתכנני ציטומטרים נמצאים בלחץ מתמיד לקצר את משך האנליזה, מה שמצריך גישות חדשות הן לציטומטריית זרימה והן לאלקטרוניקה הקשורה אליה.

ציטומטרים חושפים תאים בודדים לאור לייזר כדי ליצור אותות מפוזרים ופלואורסצנטים. כדי לקלוט במהירות ובדייקנות את האור המתקבל ולהמיר אותו לאותות דיגיטליים נדרשת פוטו-דיודת מפולת (APD) ואלקטרוניקה מורכבת. תכנון ויישום המעגלים עבור תהליך זה עשויים להימשך זמן רב, במיוחד בהתחשב בכך שמערכות איסוף נתונים של ציטומטריית זרימה דורשות התקנים במהירות גבוהה ועם רעש נמוך כדי להבטיח את דיוק המערכת.

כדי לתמוך באופן יעיל וחסכוני באנליזת ציטומטריית זרימה מהירה יותר, המתכננים יכולים להתמודד עם נושאי המהירות והדיוק באמצעות פתרון איסוף נתונים הכולל דוחפי מגבר וממיר-אנלוגי לדיגיטלי (ADC) פנימיים.

מאמר זה יציג בקצרה כיצד פועלות מערכות ציטומטריית זרימה. לאחר מכן הוא מציג את ה-ADAQ23878‏ מבית Analog Devices‏, מודול ADC‏ Bit‏-18‏, ומראה כיצד ניתן להשתמש בו כדי לתכנן דרגת גילוי והמרה של ציטומטר זרימה. תוצג גם ערכת הערכה קשורה.

עקרונות ציטומטריית זרימה מודרנית

ציטומטריית זרימה מודרנית היא תהליך אוטומטי המנתח מולקולות תאים ומשטחים, ומאפיין ומגדיר סוגי תאים שונים באוכלוסיית תאים הטרוגנית. ללא זמן ההכנה, שעשוי להיות יותר משעה, המכשיר מבצע הערכת של שלוש עד שש תכונות של 10,000 תאים בודדים תוך פחות מדקה.

כדי לאפשר זאת, שלב ההכנה לתא בודד של ציטומטריית זרימה הוא קריטי. ארגון הדגימות מתרחש בנוזל מעטפת באופן הידרודינמי כדי למקד תאים או חלקיקים לתוך זרם דגימה של קו תאים-יחידים עבור האנליזה. עם הטרנספורמציה זו, על התאים הבודדים לשמור על התכונות הביולוגיות הטבעיות ועל המרכיבים הביוכימיים שלהם.

איור 1 מציג תרשים של מכשיר ציטומטר זרימה שמתחיל בחלק העליון עם דגימת מספר תאים.

איור 1‏: תרשים של ציטומטר זרימה, ממיקוד מעטפת ועד לאיסוף הנתונים. (מקור התמונה: ויקיפדיה, התאמות על ידי Bonnie Baker)

ששת הרכיבים העיקריים של ציטומטר הזרימה הם תא זרימה, לייזר, פוטודיודת מפולת (APD), מגבר טרנס-אימפדנס (TIA‏), ממיר ADC‏ ומחשב לאיסוף וניתוח נתונים.

לציטומטר הזרימה יש זרם נוזל או נוזל מעטפת, ההופך לצר כדי לשאת וליישר את התאים לתוך קובץ יחיד דרך קרן האור. אור הלייזר לוכד תא אחד בכל פעם, ויוצר אות אור מפוזר-קדימה (FSC) ואות אור מפוזר-הצידה (SSC). אור פלואורסצנטי ממוין באמצעות מראות ומסננים ולאחר מכן מוגבר על ידי APD.

השלב הבא הוא לגלות, לבצע דיגיטציה ולנתח את פלט האור המתקבל לאחר שהוא פוגע ב-APD. עבור הגילוי, מגבר שרת FET עם רעש מתח נמוך וזרם ממתח אולטרה-נמוך 500 מגה-הרץ (MHz‏) LTC6268‏ מבית Analog Devices‏ הוא אידיאלי עבור TIA‏ במהירות גבוהה הנדרש עבור הגילוי.

איור 2: מעגל ה-TIA משתמש ב-APD‏ (_1‏PD‏) ובמגבר שרת FET עם זרם כניסה נמוך כדי להמיר זרמי פוטו-דיודה נמוכים-ביותר למתח יציאה ב- +IN1. (מקור התמונה: Bonnie Baker)

חיוני לתכנן את מעגל המגבר הזה עם רוחב-הפס הרחב ביותר האפשרי, ולכן חייבים להקטין למינימום קיבוליות פרזיטית. לדוגמה, קיבוליות המשוב הפרזיטית, C, משפיעה על יציבות ורוחב-פס המעגל שבאיור 2. ללא קשר לבחירת מארז הנגד, תמיד תהיה קיבוליות פרזיטית בנתיב המשוב של המגבר. עם זאת, מארז 0805, שלו מרחק ארוך יותר בין כיפות הקצה והקיבוליות הפרזיטית הנמוכה ביותר, עדיף עבור יישומים במהירות-גבוהה.

הגדלת המרחק בין כיפות הקצה של _1‏R‏ אינה הדרך היחידה להקטין את הקיבוליות. דרך נוספת להקטין את קיבוליות לוחית-ללוחית היא להגן על נתיבי שדה E הגורמים לקיבוליות פרזיטית על ידי הצבת פס מוליך נוסף להארקה מתחת לנגד, _1‏R‏ (איור 3).

איור 3: הוספת פס מוליך להארקה מתחת לנגד המשוב מרחיקה את שדה ה-E מצד המשוב ופורקת אותו להארקה. (מקור תמונה: Analog Devices)

במקרה זה, השיטה כוללת באופן ספציפי הצבת פס מוליך קצר להארקה מתחת ובין פדי הנגד ליד קצה היציאה של ה-TIA. טכניקה זו מניבה ערך קיבוליות פרזיטית של 0.028 פיקו-פאראד (pF) עם רוחב פס TIA של _‎1/(2π*RF_*CPARASITIC, השווה ל-MHz‏ 11.4.

אותות האור האופטיים מצביעים לעבר מספר דיודות מפולת עם מסננים אופטיים מתאימים. מערכת APD‏, TIA ו-ADC ממירה אותות אלו לייצוג הדיגיטלי שלהם ושולחת את הנתונים למיקרו-מעבד עבור ניתוח נוסף.

למכשירים מודרניים יש בדרך כלל מספר לייזרים ו-APDs. למכשירים המסחריים הנוכחיים יש עשרה לייזרים ושלושים פוטו-דיודות מפולת. הגדלת מספר גלאי הלייזר והפוטו-מולטיפליירים מאפשרת תיוג נוגדנים רבים כדי לזהות במדויק אוכלוסיות יעד על ידי סמנים פנוטיפוסיים.

ועדיין, מהירות הניתוח תלויה באיזון עדין של:

• מהירות מעטפת הנוזל
• היכולת של תהליך המיקוד ההידרודינמי ליצור קווים חד-תאיים
• קוטר המנהרה
• היכולת לשמר את שלמות התא
• האלקטרוניקה

מיקוד אקוסטי של ציטומטריית זרימה

בעוד שהוספת מספר לייזרים ו-APDs מאיצה את הניתוח והזיהוי, במקרה הטוב, שיטות הציטומטריה החד-תאית המודרניות העדכניות ביותר יכולות לאסוף נתונים על עד מיליון תאים בודדים בדקה. ביישומים רבים, כגון גילוי תאי סרטן הנמצאים בדם ברמות הנמוכות עד כדי 100 תאים למיליליטר, זה עדיין לא מספיק. ביישומים קליניים של תאים נדירים, הבדיקות דורשות באופן קבוע ניתוח גוזל-זמן של מיליארדי תאים.

האלטרנטיבה לתהליך הכנת תאים ממוקד הידרודינמית היא תהליך מיקוד אקוסטי. כאן, חומר פייזואלקטרי, כגון טיטאנאט זירקונאט עופרת (PZT‏), מוצמד לנימי זכוכית כדי להמיר פולסים חשמליים לרעידות מכניות (איור 4a‏). הודות לשימוש ב-PZT כדי להרעיד את הדפנות של נימי זכוכית בתדר התהודה של תא הזרימה המלבני, המערכת מייצרת מגוון של גלים עומדים אקוסטיים עם מספר משתנה של צומתי לחץ.

איור 4‏: תרשים של תא זרימה אקוסטי עשוי עם נימי זכוכית מלבניים (a‏). המיקום של שלושת צומתי הלחץ הראשונים עבור נימי זכוכית ברוחב קבוע (b‏). (מקור התמונה: National Center for Biotechnology Information)

צומתי PZT אלה מיישרים חלקיקים זורמים במספר קווים בדידים (איור 4b‏). תא זרימה אקוסטי משתמש בגל אקוסטי עומד לינארי כדי להתכוונן לאורכי גל שונים על ידי יצירת הרמוניות יחידות או מרובות. כפי שנחזה על ידי מודל גל עומד ליניארי פשוט, התאים בדגימה מייצרים אחד או כמה קווי תא-יחיד בתוך חלל הזרימה.

עם ארגון מדויק זה של תאים, רוחב מנהרת מעטפת הזרימה יכול להתרחב כדי לאפשר קצבי זרימה מהירים יותר מול לקרן הלייזר (איור 5).

איור 5: עם זרם דגימה הידרודינמי (c. ו-d‏), ככל שרוחב המעטפת גדל, דגימות התא מתפזרות, מה שמקשה על תהליך המדידה האופטית. זרמי דגימה ממוקדים אקוסטית (a‏ ו-b‏) שומרים על תאי קובץ-יחיד ללא קשר לרוחב המעטפת. (מקור התמונה: Thermo Fischer Scientific)

מיקוד הידרודינמי מסורתי (איור 5c.) מסדר את קווי תא-יחיד כהכנה לסריקת לייזר. בעוד שמשפך רחב יותר עבור ליבת זרם הדגימה מאפשר מהירות חומר מעטפת גבוהה יותר (איור 5d), הוא גם גורם להתרחבות סידור תא-יחיד, המייצרת שינוי אות ואיכות נתונים ירודה.

מיקוד אקוסטי (איור 5a‏) מציב תאים ביולוגיים וחלקיקים אחרים ביישור הדוק, אפילו עם מנהרה רחבה יותר. יישור תאים מדויק זה מאפשר קצבי דגימה גבוהים יותר תוך שמירה על איכות הנתונים (איור 5b‏).

בפועל, מיקוד אקוסטי של ציטומטריית זרימה מגדיל את תדר דגימת התאים ב-~20x (איור 6).

איור 6: השוואה של זמן הדגימה עבור ציודי ציטומטריית זרימה שונים המבוססת על ציטומטריית זרימת נוזל (A, B, C) לעומת ציטומטריית מיקוד אקוסטי (D). (מקור התמונה: Thermo Fischer Scientific)

באיור 6, ציוד מ-B, A ו-C משתמש בטכנולוגיה הידרודינמית, בעוד ש-D משתמש בגישת זרימת ציטומטריית מיקוד אקוסטי.

איסוף נתוני ציטומטריית מיקוד אקוסטי

תכנון האלקטרוניקה עבור ציוד ציטומטריית זרימה עם מיקוד אקוסטי דורש חישת צילום במהירות גבוהה כדי להתאים את המהירות של תאי הדם ונוזל המעטפת דרך הנחיר בקוטר הגדול יותר. ה-LTC6268 המהיר של MHz‏ 600‏ שהוזכר קודם לכן, בשילוב עם פרישת מארז נגד 0805 מיוחדת, מביאים את קצב החישה האופטית ל-MHz‏ 11.4 (איור 7, משמאל). היציאה של ה-LTC6268 מוזנת לממיר ADAQ23878 ADC מבית Analog Devices‏ לצורך דיגיטציה.

איור 7: ממיר ADAQ23878 ADC דוגם את האות האופטי מהפוטו-דיודה (_1‏PD) וממעגל TIA (משמאל). (מקור התמונה: Bonnie Baker)

ה-ADAQ23878 הוא פתרון איסוף נתונים מדויק במערכת-בתוך-מארז (SIP‏) במהירות גבוהה של 15 מגה-דגימות בשנייה (MSPS) ב-Bit‏-18‏. הוא מקצר במידה ניכרת את מחזור הפיתוח של מערכות מדידה מדויקות על ידי העברת נטל התכנון של בחירת רכיבי דוחף כניסה, אופטימיזציה ופרישה מהמתכנן אל ההתקן.

הגישה המודולרית של ה-SIP מפחיתה את מספר רכיבי מערכת הקצה על ידי שילוב של מספר בלוקים של עיבוד אותות ואכשור בהתקן יחיד, לצד ממיר ADC עם רגיסטר קירוב-עוקב (SAR‏) מהיר, Bit‏-18‏, MSPS‏ 15‏. בלוקים אלה כוללים מגבר דוחף ADC דיפרנציאלי-במלואו עם רעש נמוך וחוצץ ייחוס יציב.

ה-ADAQ23878 משלב גם את הרכיבים הפסיביים הקריטיים המשתמשים בטכנולוגיית iPassive של Analog Devices כדי להקטין למינימום מקורות שגיאה תלויי-טמפרטורה ולמטב את הביצועים. דרגת הדוחף עם התייצבות-מהירה של ה-ADC תורמת ליכולתו להבטיח קליטת נתונים מהירה.

הערכת ADAQ23878 µModule

כדי להעריך את ה-ADAQ23878‏, Analog Devices‏ מספקת את לוח ההערכה EVAL-ADAQ23878FMCZ‏ (איור 8). הלוח מדגים את הביצועים של ADAQ23878 μModule ומהווה כלי ורסאטילי עבור תכן קצה-קדמי לציטומטריית זרימה ועבור מגוון של יישומים אחרים.

איור 8: לוח ההערכה EVAL-ADAQ23878FMCZ עבור ה-ADAQ23878 כולל מעגלי הספקת-כוח על-הלוח, הוא מגיע עם תוכנה נלווית עבור בקרה וניתוח נתונים והוא תואם SDP-H1. (מקור תמונה: Analog Devices)

לוח ההערכה EVAL-ADAQ23878FMCZ דורש מחשב אישי עם מערכת הפעלה Windows 10 ומעלה, רעש נמוך, מקור אות מדויק ומסנן מעביר-פס המתאים עבור בדיקות Bit‏-18‏. לוח ההערכה זקוק לתקיע ACE‏ ADAQ23878 ולדוחף SPD-H1.

סיכום

הבחינה של תא ביולוגי אחד בכל פעם באמצעות טכניקות סטנדרטיות של ציטומטריית זרימה עם מיקוד הידרודינמי הצליחה, אך עם הצורך בניתוח מהיר יותר, התרחש מעבר לטכניקות המבוססות על שיטות זרימה עם מיקוד אקוסטי. עם זאת, האלקטרוניקה התומכת בציטומטריית זרימה מתקדמת יותר חייבת להשתפר, תוך הקטנה למינימום של המקום, העלות וזמן הפיתוח.

כפי שהוצג, ניתן לשלב את מגבר השרת במהירות גבוהה LTC6268‏ ו-μModule‏ ADAQ233878 המדויק במהירות גבוהה כדי ליצור את מערכת איסוף נתונים שלמה עבור ציוד ציטומטריית זרימה מתקדם.